在健康动物身体各部分正常存在的微生物群落也叫正常菌群。对于水产动物而言，正常菌群存在于胃肠道、鳃部、体表和口腔等各个部位。动物为它们提供未完全消化的食物作为营养，而它们则为宿主进一步降解食物，补充蛋白质和氨基酸，提供合成的维生素。它们在改善动物生理机能和提高宿主免疫力等方面发挥重要的作用。水体菌群是鱼类养殖环境中高效的有机物分解者，亦是生态系统的营养源，在养殖环境生态系统的物质循环和能量流动中发挥着巨大作用。正常菌群和水体菌群间交流密切、互有迁移、互相影响，它们与宿主机体间形成相互依赖、相互制约的统一整体。

动物与菌群间的动态平衡能有效地抑制有害病菌的异常繁殖和生长(马英等, 2009)，反之则有可能导致疾病的发生。周金敏等(2010)对比了健康和患病的黄颡鱼肠道菌群数量和组成发现，患病鱼体肠道细菌数量相对于健康的鱼体显著增加，特别是气单胞菌属数量增加了18.3%~33.6%，而菌群组成种类相对减少，由此可推断气单胞菌属等致病菌的大量增殖引起正常菌群的失衡而导致肠道疾病的发生。

欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鳗鲡目(Anguilliformes)、鳗鲡科(Anguillidae)、鳗鲡属(Anguilla Shaw) (林旋等, 2008)，是我国鳗鲡养殖业的重要品种之一。在研究健康鳗鲡肠道菌群方面，樊海平等(2005; 2006)学者做了一些工作，但现有菌群研究的报道均未涉及鳗鲡鳃部、体表等部位，亦未将水体菌群作为整体进行系统考察。

本研究从鳗鲡不同体位及其养殖水体中分离可培养细菌，利用16S rDNA方法对其进行分子鉴定，并分析其细菌数量与组成，寻找细菌在鳗鲡鱼体与其养殖水体中的分布规律，以期为纠正鳗鲡机体失调菌群，增强机体体质，提高抗病力和微生态制剂的开发提供一定的理论依据，从而促进鳗鲡养殖业的健康持续发展。

1结果与分析

1.1鳗鲡不同体位及其养殖水体中可培养细菌数量

鳗鲡鳃部(G)、肠道(E)和表皮(S)及其养殖水体(W)的样品经稀释涂布培养并计数，其菌密度分别是1.6×10⁶ cfu/g、2.2×10⁷ cfu/g、1.4×10⁴ cfu/cm²和4.5×10³ cfu/mL。

1.2细菌16S rDNA的系统发育分析

鳗鲡各部位和水体样品平板培养的菌落根据形态特征共分为A、B、C、D、E和F等6种菌落类型，各分型菌落以大于10%的比例抽样鉴定。鳗鲡鳃部、肠道、表皮和养殖水体菌群中分别抽样分离了18株、12株、28株和18株菌株，经16S rDNA序列测定和分析，形成的OUT (optional taxonomic unit, 运算分类单元)分别为9个、5个、9个和6个(表1~表4)。

结合各菌群每个OTU的代表菌株及其在GenBank上比对的最相似菌株的16S rDNA序列构建系统发育树，结果显示，鳗鲡不同体位及其养殖水体所分离的可培养菌群为γ-变形菌纲的肠杆菌属、不动杆菌属、栖水菌属，β-变形菌纲的食酸菌属，芽孢杆菌纲的葡萄球菌属、气球菌属，黄杆菌纲的金黄杆菌属和放线菌纲的微球菌属等5大类8个菌属(图1)。

1.3鳗鲡不同体位及其养殖水体中可培养菌群组成分析

    在鳗鲡和水体菌群涉及的8个菌属中，微球菌属、肠杆菌属和肠杆菌属分布最广，在各样品都有发现；而气球菌属和食酸菌属只在鳃部分离到。鳃部菌群多样性最为丰富，含有除葡萄球菌属外的7个菌属，以金黄杆菌属和肠杆菌属居多，分别为28.3%和26.1%，其次是微球菌属和栖水菌属，分别15.7%和14.7%；肠道则以微球菌属(43.6%)和肠杆菌属(24.8%)占优势，其它菌属有栖水菌属、不动杆菌属和葡萄球菌属；而表皮比肠道多了金黄杆菌属，优势菌群是微球菌属(53.5%)和栖水菌属(27.7%)；养殖水体菌群种类最少，除了占有绝对优势的微球菌属(74.8%)和比较多的葡萄球菌属(17.8%)外，还有肠杆菌属和栖水菌属(图2)。

2讨论

2.1养殖鳗鲡不同体位及其养殖水体可培养细菌菌群分析

2.1.1菌密度

本研究中鳗鲡肠道相对于其它部位有比较高的菌密度(2.2×10⁷ cfu/g)。赵庆新(2001)研究得出草鱼、白链鱼、团头鲂和鲤鱼4个品种的成鱼肠道菌密度(10⁶~10⁷ cfu/g)也较高，这可能因为肠道是营养物质消化和吸收的主要场所，因此能为细菌提供更为丰富的营养物质，更适合细菌的生长和繁殖。除肠道外，本研究中鳃部菌密度(1.6×10⁶ cfu/g)也较高，这与Trust (1975)在淡水鲑鱼鳃部菌群(10⁶ cfu/g)中的研究结果相仿。鳃部菌密度高主要是因为鳃部的滤水作用，而实际上有报道(Cahill, 1990)认为细菌在健康鱼类鳃部的覆盖面积仅占总面积的0.1%~1.0%。有学者(Austin, 2002)总结鱼类表皮细菌数量比较少，一般在10²~10⁴ cfu/cm²，本研究中表皮菌密度为1.4×10⁴ cfu/cm²，鳗鲡表皮上的这些正常菌群与粘液一起形成阻碍致病菌入侵的第一道屏障。本研究中鳗鲡的养殖水体菌密度(4.5×10³ cfu/mL)较低，这主要是因为研究对象养殖于精养水泥池，日换水30%以上，水体洁净，细菌在水体中没有稳定生长繁殖的场所。凌泽春等(2009)报道斜带石斑鱼幼鱼养殖水体的可培养细菌菌密度为5.4×10⁵ cfu/mL，而Nahiduzzaman等(2000)研究养殖鲶鱼水体菌密度的变化范围为2.1×10³~4.1×10⁶ cfu/mL。有数据表明生物滤器的使用可以对细菌有消除作用，即水体细菌的数量反映了水体的质量，污染比较严重的水体细菌数量往往比较高(Zmyslowska et al., 2001)。

2.1.2菌群组成

本研究中鳗鲡不同体位及其养殖水体菌群组成与其它报道的有所不同。Olojo等(2010)研究了近黑歧须鮠和非洲鲶鳃部、肠道和表皮的菌群结构，主要有金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌、绿脓假单胞菌、链球菌和大肠杆菌等。Efuntoye等(2012)从健康非洲鲶鳃部和肠道分离的菌株属于爱德华菌属、埃希氏菌属、摩根菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属和葡萄球菌属，其中大肠杆菌是优势菌。赵庆新(2001)对草鱼、白鲢、团头鲂和鲤鱼的肠道菌群进行分离鉴定，发现4种鱼肠道有哈夫尼亚菌属、致病杆菌属、气单胞菌属、柠檬酸菌属、假单胞菌属、链球菌属和葡萄球菌属等。周金敏等(2010)研究的黄颡鱼肠道和养殖水体菌群主要涉及气单胞菌属、棒杆菌属、微球菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、莫拉氏菌属、黄杆菌属、肠杆菌属和弧菌属等。综合看来，葡萄球菌属、肠杆菌属、假单胞菌属和气单胞菌属在许多水产动物正常菌群的研究报道中都曾出现，而本研究中欧洲鳗鲡正常菌群与水体菌群除了葡萄球菌属和肠杆菌属外，还涉及不动杆菌属、栖水菌属，食酸菌属、气球菌属、金黄杆菌属和微球菌属等。尽管本研究中鳗鲡菌群与其它报道的不大一致，但在鱼体不同体位之间以及与养殖水体之间菌群组成是相似的，这表明菌群组成可能受动物种属和养殖水环境影响。

Cahill (1990)分析总结无论是海水鱼类还是淡水鱼类，鳃部菌群种类都比较多样，而肠道菌群相对于周围水环境的要简单。本研究也发现欧洲鳗鲡鳃部菌群相对于其它部位多样性更为丰富，但水体菌群种类最少，并不比肠道菌群更复杂，这可能也是因为精养池换水频繁的缘故。

2.2细菌16S rDNA基因序列比对所选用的数据库

    将获得序列在NCBI网站上比对所选数据库不同时，会出现最近缘菌种甚至菌属的结果不一致导致分类歧义的问题。如GC3的16S rDNA比对时，数据库若选择16S ribosomal RNA sequences (bacteria and archaea)，比对结果显示同源性最高菌株为Enhydrobacter aerosaccus (NR_029005, 99%)；而选择Nucleotide collection (nr/nt)，则显示为Moraxella osloensis (JX845725, 100%)。二者比对结果有较大的差异，EC4、SC3、SB1和WE3等序列也存在类似的情况。

    Nucleotide collection数据库收录所有核酸序列，但是它的收录门槛较低，对细菌16S rDNA序列的提交者未做更严格的要求，比如提供该菌种的生理生化鉴定报告等，这就可能导致了该库中某些16S rDNA序列的细菌种属定位是不准确的。不过，GenBank管理者显然也清楚会有这种情况的发生，因此，对来自一些权威菌种保藏中心，或者有严谨细菌鉴定报告或论文的序列，经核查和验证收录在16S ribosomal RNA sequences数据库中，其序号前面均冠以”NR_”。该库中16S rDNA序列所对应的细菌分类定种无疑更加精确和值得信赖。基于这一现象，笔者最终采用16S ribosomal RNA sequences数据库进行比对和构建系统发育树。近年来，由于GenBank中细菌16S rDNA序列的海量递增，个别提交序列所对应的细菌种属信息如有谬误极可能导致后来比对者一系列的连锁错误，因此建议研究者在进行细菌16S rDNA序列比对时考虑选用这个可靠性和针对性更强的专门数据库。

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1鳗鲡及其养殖水体来源：龙岩市大池鳗鱼养殖场

3.1.2主要试剂及仪器

Taq酶、dNTP Mix购自Fermentas公司；16S rDNA通用引物由南京金斯瑞公司合成；DNA ladder、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生物公司；PCR基因扩增仪和自动凝胶成像系统均购自Bio-Rad公司。

3.2实验方法

3.2.1样品制备

无菌解剖鳗鲡，取其鳃部(1.024 g)、肠道(0.710 g)、表皮(4.5 cm²)分别加入5 mL生理盐水，用匀浆机匀浆后，取1 mL浆液进行10倍梯度稀释至10^-7。

取采集的养殖水体1 mL按10倍梯度稀释至10^-4。

3.2.2细菌的培养与计数

上述样品各取3个合适稀释度0.1 mL涂布营养琼脂平板，每个稀释度涂布3个平板，28℃恒温培养24 h后选取菌落清晰、分散且菌落数在30~300个之间的平板，根据菌落的大小、形状、颜色、边缘、隆起、透明、湿润和光滑等特征进行菌落分型和计数。之后按一定比例抽取一部分菌株进行分离和纯化，将纯化菌株转接液体培养基中摇床培养24 h后提取基因组DNA。

3.2.3细菌DNA的提取

细菌基因组DNA的提取用试剂盒方法进行。

3.2.4细菌16S rDNA的PCR扩增和序列分析

PCR扩增采用通用引物：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

反应体系：5 μL 10×Taq DNA Buffer，dNTPs (10 mmol/L)、引物27F (10 μmol/L)和1492R (10 μmol/L)各1 μL，3 μL MgCl₂ (25 mmol/L)，0.25 μL Taq酶(5 U/μL)，0.5~1 μg DNA模板，补ddH₂O至50 μL。

反应条件：94℃预变性10 min、94℃变性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸1.5 min，共31个循环，72℃终延伸10 min。

扩增后的PCR产物纯化后送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，测得的序列用BLASTN程序在GenBank中进行同源性检索并用Mothur软件对其进行OTU分析(阀值为97%)，程序选出的代表菌株与GenBank中的参考菌株通过MEGA 5.10软件采用邻接法(neighbour-joining method)构建系统树。

作者贡献

梁晶晶负责实验的指导和文章的撰写；林茂为通讯作者，负责实验的构思和项目管理，在实验操作、数据处理和论文写作方面也给予了巨大帮助；陈智生和丁昭仪负责实验操作和数据处理；高丹莉和邵梦燕负责样品采集和实验辅助。

致谢 

    本研究由公益性行业(农业)科研专项(201203085)、国家自然科学基金(31202030)、中国科学院城市环境与健康重点实验室开放课题(KLUEH201106)、国家级大学生创新创业训练计划项目(Z81236)共同资助，在此表示感谢！

参考文献 

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